ГИДРОЛИЗ МОЛОЧНЫХ БЕЛКОВ ПРОТЕАЗАМИ ШТАММОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ И ИХ ГИПОАЛЛЕРГЕННЫЕ СВОЙСТВА

HYDROLYSIS OF MILK PROTEINS BY PROTEASES OF LACTIC ACID BACTERIA STRAINS AND THEIR HYPOALLERGENIC PROPERTIES

Mustafayeva R.S, Abdullayeva N.F.

Baku State University, Senior Assistant, Assistant professor

ГИДРОЛИЗ МОЛОЧНЫХ БЕЛКОВ ПРОТЕАЗАМИ ШТАММОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ И ИХ ГИПОАЛЛЕРГЕННЫЕ СВОЙСТВА

Мустафаева Р.С., Абдуллаева Н.Ф.

Бакинский Государственный Университет, старший лаборант, доцент

Abstract

The aim of this work was to optimize the hydrolysis of milk proteins by various proteases of lactic acid bacteria (LAB) and enzymatic hydrolysis of milk proteins for the manifestation of their hypoallergenic properties. The amount of partial hydrolysates of whey proteins obtained using pepsin in α-LA is 100%, and using papain in β-LQ is 61.8 ± 4.8%; α-LA-100%. When using thermolysin, trypsin and alcalase in β-LQ and α-LA-100%, respectively. In neutral and alkaline media, papain, trypsin, alcalase, and thermolysin efficiently cleaved β-LQ, and under optimized conditions, these enzymes cleaved α-LA. Casein is considered the main source of protein for the production of hypoallergenic protein hydrolysates. Casein hydrolysis was carried out in 2 stages: protease hydrolysis with LAB strains and pepsin hydrolysis. As a result, during the fermentation of milk proteins, some LAB produce biologically active peptides that are relevant in the development and organoleptic, hypoallergenic properties of fermented milk products.

Аннотация

Целью данной работы была оптимизация гидролиза белков молока различными протеазами молочнокислых бактерий (МКБ) и ферментативный гидролиз белков молока для проявления их гипоаллергенных свойств. Количество частичных гидролизатов сывороточных белков полученных с применением пепсина в α-LA 100%, а с применением папаина в β-LQ 61,8±4,8%; α- LA-100%. При применении термолизин, трипсин и алкалазы в β-LQ и α- LA-100%, соответственно. В нейтральных и щелочных средах папаин, трипсин, алкалаза и термолизин эффективно расщеплял β-LQ, а в оптимизированных условиях эти ферменты расщепляли α- LA. Казеин считается основным источником белка для получения гипоаллергенных белковых гидролизатов. Гидролиз казеинов проводился в 2 этапах: гидролиз протеазами штаммами МКБ и гидролиз пепсином. В результате при ферментации молочных белков некоторыми МКБ образуются биологически активные пептиды, которые являются актуальными при разработке и органолептическими, гипоаллергенными свойствами ферментированных молочных продуктов.

Keywords: lactic acid bacteria, milk protein hydrolysis, proteases of LAB, protein hydrolysis optimization, hypoallergenic milk proteins

Ключевые слова: молочнокислые бактерии, гидролиз молочных белков, протеазы МКБ, оптимизация гидролиза белков, гипоаллергенность молочных белков

Полноценная пища должна содержать белки, жиры, углеводы, витамины и должна быть разнообразной. Жиры и углеводы считаются источниками энергии и в определенных пределах они взаимозаменяемы. Их можно заменить белками, но белки ничем заменить нельза.

Белки входящие в состав молока по строению, физико-химическим свойствам и биологическим функциям разнообразны и в молоке в среднем содержится около 3,2% белка. Кроме белка в молоке содержится азотистые соединения небелкового характера: свободные аминокислоты, пептиды, мочевина, аммиак, мочевая кислота [1, с. 384]. Исследователи используя современные способы разделения и выделения белков установили, что в состав молока входит три группы белков. Первая основная группа эта казеин, содержащий 4 фракции: αs₁, αs_2, β и κ казеин и их фрагменты. Вторая группа состоит из сывороточных белков β-лактоглобулин и α-лактоальбумина, иммуноглобулинов и альбуминов сыворотки крови [18, с. 105-112]. Кроме того, в эту группу входит лактоферрин и так называемые минорные белки. Третья группа эта белки оболочек жировых шариков. Они составляют всего 1 % всех белков молока. Изучение вторичной и третичной структур белков молока показало что, казеин в отличии от обычных глобулярных белков почти не содержит α-спиралей, а α-лактоальбумина, а β-лактоглобулин содержит большее количество спирализованных участков. Структура казеина обеспечивает хорошую расщепляемость казеина протеолитическими ферментами при переваривании в нативном состоянии без предварительной денатурации [7, с.217-246; 12, с. 587-592; 13, с. 3472-3478].

Продукты с низким аллергенным потенциалом и высокой питательной ценностью можно получить при ферментативном гидролизе белкового компонента молока [3, с. 35; 10, с. 331-334]. При потреблении гидролизованных белков достигается положительный физиологический эффект. Этот эффект по сравнению с нативными белками и аминокислотами достигается за счет лучшего усвоения короткоцепочечных пептидов в кишечном тракте [2, с 263-272; 10, с. 331-344].

Для пищевой и фармацевтической промышленности получение гипотензивных, антимикробных, иммуностимулирующих, антифунгальных и с другими эффектами биологически активных пептидов, представляет особый интерес [16, с. 3101-3106]. Протеолиз является важным биохимическим процессом при получении различных ферментированных продуктов. Протеолитическая система, участвующая в распаде казеина, обеспечивает клетки незаменимыми аминокислотами во время роста в молоке и также имеет промышленное значение за счет развитие органолептических свойств в ферментированных молочных продуктах [12, с. 587-592]. Протеолитическая система состоит из внеклеточной серин-протеиназы и транспортных систем, специфичных для ди-трипептидов и олигопептидов. Модель протеолитического пути состоит из: -(I) протеиназы имеющую широкую специфичность и способность высвобождать большое количество различных олигопептидов, -(II) транспорта олигопептидов являющихся основным путем поступления азота в клетку; -(III) всех пептидаз расположенных внутриклеточно. Для полного распада накопленных пептидов требуется действие всех пептидаз [14, с. 105-110; 15, с. 187-221; 17, с. 109-115]. Изучение физиолого-биохимических и промышленно ценных свойств молочнокислых бактерий в частности Lb.helveticus A7, Lb.paracasei A582, E. faecalis AN1, E. faecalis A121 и др. является актуальным направлением исследований прикладной биотехнологии, что связано с широким применением микроорганизмов в различных отраслях молочной промышленности, в частности сыроделии, при изготовлении йогуртов и заквасок [22, с. 969-973]. Как известно бактерии нуждаются в экзогенном источнике пептидов и аминокислот, которые образуются из основного белка молока — путем гидролиза казеина. Казеин расщепляется бактериальной протеазой, которая связана с клеточной стенкой. Образовавшиеся олигопептиды поглощаются посредством специфического пептидного транспорта и в дальнейшем под действием различных внутриклеточных пептидаз расщепляются на короткоцепочечные пептиды и аминокислоты [13, с. 3472-3478; 20, с 1395-1410; 21, с. 139-155]. При ферментации казеина некоторыми МКБ образуются биологически активные пептиды. Эти пептиды являются актуальными при разработке продуктов функциональной направленности (таблица1). Так пептидный и аминокислотный профиль гидролизованного белка молока определяет биологически активные, органолептические и гипоаллергенные свойства ферментированных продуктов [6, с. 207-228; 19, с. 16-20].

Материалы и методы

Оптимизация гидролиза белков молока различными протеазами. Расщепление белков-аллергенов осуществляют с использованием широкого спектра протеаз – ферментов класса гидролаз. Гидролазы катализируют гидролитический разрыв пептидных связей. Среди них известны ферменты микробного -алкалаза, нейтраза, термолизин, животного -пепсин, трипсин, химотрипсин и растительного происхождения -папаин, бромелаин, фицин [5, с. 159-203]. У этих ферментов различные механизмы каталитического действия. Изучение особенностей гидролиза белков молока специфическими протеазами, а также при совместном их воздействии направлено на установление оптимальных параметров. Этими параметрами являются получения частичного гидролизата с заданным пептидным составом, а также иммунохимическими свойствами как компонента продуктов специализированного питания [4, с. 209-223; 11, с. 4772-4778]. Белки коровьего молока представляют собой первый источник антигенов, встречающихся в больших количествах в младенчестве. Среди этих антигенов β-лактоглобулин (β-LG), α-лактальбумин (α-LA) и казеины являются основными аллергенами в коровьем молоке [12, с. 587-592].

Согласно исследованиям по оптимизации условий гидролиза основных сывороточных белков сериновыми (алкалаза и трипсин), аспарагиновой (пепсин) и цистеиновой (папаин) протеазами, металлопротеазами (термолизин) комплексными ферментными препаратами представлена сравнительная характеристика соответствующих частичных гидролизатов (таблица 1).

Таб: 1 Количество частичных гидролизатов сывороточных белков полученных с применением различных протеаз

Ферментативный гидролиз белков молока как путь их гипоаллергенности

Под действием различных технологических приемов может быть снижена аллергенность молочных продуктов. Для молекулярного изменения аллергенного потенциала белков, разрушается область антигенных эпитопов или формируются новые. В результате денатурации аллергена облегчается доступ к ранее скрытым эпитопам [5, с. 159-203].

Один из путей снижения аллергенности молочных продуктов- это ферментативный гидролиз.

Механизм ферментативного катализа состоит из трех последовательных реакций. Во первых образуется комплекс Михаэлиса из белка (субстрата) и фермента. Вторая реакция это разрыв пептидной связи и высвобождения одного пептида. На последней стадии оставщийся пептид отделяется от фермента после нуклеофильной атаки, которую осуществляет молекула воды [5, с.159-203].

Казеин считают основным источником белка для получения гипоаллергенных белковых гидролизатов. При протеолизе казеина основным недостатком является неприятный вкус и запах. Для изготовления гипоаллергенных молочных смесей также используют гидролизаты сывороточных белков. При введении в состав молочных смесей сывороточных белков необходимо уменьшить содержание ароматических аминокислот [8, с. 254-258].

Протеолиз казеинов проводили по методике, описанной Mouecoucou и соавт. [15, с. 187-221]. Гидролизат казеинов штаммом, а также нативный субстрат, подвергали дальнейшему гидролизу пепсином. Гидролиз пепсином проводили в течении 1 часа при рН 2.0 и температуре 37 °С.

Результаты и их обсуждение

Папаин, трипсин, алкалаза, термолизин эффективно расщепляет β-лактоглобулин в нейтральных и щелочных средах. В оптимизированных условиях эти ферменты расщепляют α-лактоальбумин.

При гидролизе β-лактоглобулина и α-лактоальбумина термолизином предподчительным является рН 8. При 70⁰С была показана максимальная степень протеолиза. Была показана высокая эффективность гидролиза сывороточных белков при использовании трипсина и алкалазы. Для получения белкового компонента с низким антигенным потенциалом является выбор таких ферментов как термолизин, трипсин и алкалаза [3, с.35-39; 4, с. 209-233].

Гидролиз казеинов проводился в два этапа: гидролиз протеазами штаммами молочнокислых бактерий и гидролиз пепсином. Профиль протеолиза на этапах гидролиза протеазами штамма молочнокислых бактерий и гидролиза пепсином было показана на рис:1.

Рис.1 Протеолиз казеинов протеазами штамма молочнокислых бактерии и пепсином. Линии 1, 3, соответствуют контролям, линии 2, 4 гидролизатам казеинов штаммом молочнокислых бактерий. I этап – гидролиз штаммами молочнокислых бактерий, II этап – гидролиз пепсином.

Как видно с рисунка частичный гидролиз в образованием большого количества пептидов происходит (линия 2) после 3 ч. инкубации клеток штамма с субстратом. Профиль пептидов отличался для контроля и гидролизата (линии 3 и 4). В результате предварительный гидролиз казеинов протеазами штамма молочнокислых бактерий улучшал их переваривание пепсином.

Представлено эффективность применения алкалазы, трипсина или термолизина для гидролиза нативных β-лактоглобулина и α-лактальбумина, обеспечивающих получение белкового компонента с содержанием пептидной фракции 90,9–98 %.

В результате были охарактеризованы гидролизаты казеина и сывороточных белков, которые полученны с применением ферментов с различными механизмами каталитического действия и путем ферментации протеолитическими системами промышленно-ценных молочнокислых бактерий.

Было обосновано совместное использование таких протеаз как алкалазы и трипсина. Их использовали для увеличения степени гидролиза белков молочной сыворотки и для снижения остаточной антигенности продуктов протеолиза. В результате для продуктов специализированного питания был разработан способ получения частичного гидролизата сывороточных белков. Для расщепления всех белков-аллергенов способ получения частичного гидролизата сывороточных белков является преимущественным.

Литература

1. И.А. Рогов, Л.В Антипова, Н.И Дунченко, Н.А Жеребцов Химия пищи: Белки: Структура, функции, роль в питании // В 2-х кн. Кн.1- М.: Колос, 2000.- 384 с.

2. Т.Н. Головач [и др.] Изучение особенностей ферментации белков молока (казеиновой и сывороточной фракций) мезофильными и термофильными лактобациллами //Актуальные вопросы переработки мясного и молочного сырья: сб. научн. тр. 2011. Вып. 6 /РУП «Институт мясо-молочной промышленности»; редкол.: А.В. Мелещеня [и др.] – Минск, РУП «Институт мясо-молочной промышленности», 2012. – С. 263–272.

3. Т.Н. Головач, В.П. Курченко , Н.К. Жабанос Характеристика частичного гидролизата сывороточных белков, полученного с использованием термостабильной бактериальной эндопептидазы // Инновационные процессы в АПК: материалы 125 III Междунар. науч.-практ. конф. преподавателей, молодых ученых и студентов, г. Москва,13–15 апреля 2011 г. / ФГОУ ВПО Российский университет дружбы народов. – М: РУДН

4. Т.Н. Головач, В.П. Курченко, Л.И Сурвило Антигенные свойства нативных и термообработанных сывороточных белков и их частичных ферментативных гидролизатов // Труд. Белорусск. гос. ун-та. Сер.: Физиологические, биохимические и молекулярные основы функционирования биосистем. – 2011. – Т. 6, Ч. 1. – С. 209–223.

5. Adler-Nissen, J. // In Enzymes in food processing; T. Nagodawithana, G. Reed, Eds.; Academic Press: San Diego. – 1993. – P. 159–203.

6. Besler M., Steinhart H., Paschke A. Stability of food allergens and allergenicity of processed foods / M. Besler,H. Steinhart, A. Paschke // J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. – 2001. – Vol. 756. – P. 207–228.

7. Christensen J.E [et al.] Peptidases and amino acid catabolism in lactic acid bacteria //Antonie Van Leeuwenhoek. – 1999. – Vol. 76. – P. 217–246.

8. Clemente A. Enzymatic protein hydrolysates in human nutrition // Trendsin Food Science and Technology. – 2000. – Vol. 11. – Р. 254–

9. Doeven M.K., Kok J., Poolman B. Specificity and selectivity determinants of peptide transport in Lactococcuslactis and other microorganisms // Mol. Microbiol. – 2005. –Vol. 57. – P. 640–649.

10. Edwards P.J.B. [et al.] Heat-resistant structural features of bovine β-lactoglobulin A revealed by NMR H/Dexchange observations // Int. Dairy J. – 2002. – Vol. 12. – P. 331–344.

11. Fernandez-Espla M.D. [et al.] Streptococcus thermophilus cell wall-anchored proteinase: release, purification, and biochemical and genetic characterization // Appl. Environ.Microbiol. – 2000. – Vol. 66. – P. 4772–4778.

12. Heyman, M. Evaluation of the impact of food technology on the allergenicity of cow’s milk proteins // Proc. Nutr. Soc. – 1999. – Vol. 58, № 3. – P. 587–592.

13. Juillard V. [et al.] The extracellular PI-type proteinase of Lactococcus lactis hydrolyzes β-casein into more than one hundred different oligopeptides // J. Bacteriol. – 1995. – Vol. 177. –P. 3472–3478.

14. Kleber N. [et al.] The antigenic response of β-lactoglobulin is modulated by thermally induced aggregation // Eur. Food Res. Technol. – 2004. – Vol. 219. – P. 105–110.

15. Kunji E.R.S. [et al.] The proteolytic systems of lactic acid bacteria // Antonie Van Leeuwenhoek. – 1996. – Vol. 70. – P. 187–221.

16. Laan H., Konings W.N. Mechanism of proteinase release from Lactococcus lactis ssp. cremoris Wg2 // Appl. Environ. Microbiol. – 1989. – Vol. 55. – P. 3101–3106.

17. Minami [et al.] Oligopeptides: mechanism of renal clearance depends on molecular structure / H. // Am. J. Physiol. – 1992. – Vol. 263, № 2. – P.109–115.

18. Mouecoucou, J.; Villaume, C.; Sanchez, C.; Mejean, L. β-Lactoglobulin/ polysaccharide interactions during in vitro gastric and pancreatic hydrolysis assessed in dialysis bags of different molecular weight cut-offs. Biochim.Biophys.Acta 2004, 1670, 105–112.

19. Paschke A., Besler M. Stability of bovine allergens during food processing //Ann. Allergy Asthma Immunol. – 2002. – Vol. 89. – P. 16–20.

20. Peterson, S.D., Marshall R.T. Nonstarter lactobacilli in Cheddar cheese: a review // J. Dairy Sci. – 1990. – Vol. 73. – P. 1395–1410.

21. Siezen, R.J. Multi-domain, cell-envelope proteinases of lactic acid bacteria //Antonie Van Leeuwenhoek. – 1999. – Vol. 76. – P. 139–155.

22. Takagi [et al.] K. Comparative study of in vitro digestibility of food proteins and effect of preheating on the digestion // Biol. Pharm. Bull. – 2003. – Vol. 26, № 7. – P. 969–973.