Постановка проблемы. Среди вирусных болезней злокачественной природы (рак крови) сельскохозяйственных животных наибольшую опасность представляет лейкоз крупного рогатого скота. Заболевание вызывается РНК-содержащим вирусом тип С семейства Retroviridae рода Deltaretrovirus. Болезнь поражает кроветворную систему и заканчивается формированием злокачественных опухолей в органах и тканях, а затем, гибелью животного [1, p. 1297–1305].
Основой борьбы с инфекционными заболеваниями является защита чувствительных животных специфическим иммунитетом [2, 544 с.]. В последнее время лейкоз КРС распространен во многих странах мира, в том числе и в Украине [3]. Наиболее эффективным методом борьбы с болезнями вирусной этиологии является защита чувствительных животных поствакцинальным иммунитетом, но такие препараты еще находятся в стадии разработки. Проблема профилактики и борьбы с лейкозом КРС остается актуальной.
Анализ последних исследований и публикаций. Социальное значение заболевания базируется на аналогичности протекания патологии у разных видов животных и людей. Хотя сегодня лейкоз КРС не отнесен к инфекционным заболеваниям антропозоонозной категории – случаев возникновения и развития непластичных процессов у людей из-за инфицирования ВЛКРС в мировой практике не зарегистрировано. В тоже время, по данным Горбатенко С.К., уже длительный период известна возможность ВЛКРС индуцировать развитие инфекционного процесса не только в организме родственных животных, но и у овец, коз, свиней, кролей, мышей, приматов. Больше того, возбудитель лейкоза КРС успешно размножается на культуре клеток человека, а скармливание обезьянам сырого молока и мяса от больного лейкозом крупного рогатого скота провоцирует непластичный процесс. Проблематика опасности ВЛКРС для человека инициируется накоплением научной информации о близкой генетической родственности возбудителя лейкоза крупного рогатого скота и вируса Т-клеточного лейкоза человека HTLV-1. Установлена гомология последовательностей между р24 ВЛКРС и главным белком р24 вируса HNLV-1; структура провирусного генома ВЛКРС сходна аналогичному показателю возбудителя Т-клеточного лейкоза человека, установлена гомологичность их pol-генов. Особенное внимание заслуживает предположение исследователей, на основании анализа геномов ВЛКРС и HNLV-1, про абсолютно обоснованное предположение относительно существования общего предшественника обоих вирусов [4, С. 807–810; 5, С. 191–197; 6, С. 14–15; 7, р. 12–21; 8 р. 1210–1248].
В Украине до 1985 г. борьба с заболеванием проводилась посредством выявления больных лейкозом животных на основе клинико-гематологических признаков. На сегодняшний день борьба с лейкозом КРС на территории Украины регламентируется соответствующим документом («Інструкція з профілактики та оздоровлення великої рогатої худоби від лейкозу»). Основным методом борьбы и профилактики с лейкозом КРС является выявление с помощью диагностических методов РИД, ИФА и ПЦР позитивно реагирующих животных. Животных изолируют, и после повторного подтверждения диагноза проводится убой [9, 13 с.]. В практике широко используется определение антител к вирусу лейкоза ВРХ в сыворотке крови, в реакции РИД. Метод РИД имеет высокую специфичность, но низкую чувствительность [10, p. 1459–1469]. Не всегда, получается, выявить всех зараженных животных, особенно при диагностике лейкоза у молодняка КРС. Такие животные могут долгое время не проявлять признаков заболевания и являться потенциальными носителями инфекции. Поиск альтернативных методов борьбы с лейкозом КРС привел к разработке новых методов профилактики заболевания. На сегодняшний день известны разработки препаратов для профилактики лейкоза, как в нашей стране, так и за рубежом, но они находятся в стадии испытаний [11, c. 44–46; 12, 3 с.; 13, c. 151–158].
Выделение нерешенных ранее частей проблемы. При современной комплексной диагностике лейкоза КРС остается нерешенной проблема профилактики и лечения заболевания. Создание и апробация новых иммуногенных противолейкозных препаратов требует тщательного исследования влияния нового препарата не только на организм чувствительных животных, но прежде всего на организм лабораторных животных, которые чаще всего применяются для серийного контроля качества и сертификации препарата.
Цель статьи. Исследование влияния препарата «Лейкозав» против лейкоза крупного рогатого скота на иммунный статус лабораторных животных (крыс).
Изложение основного материала. Исследования проводились в виварии Института биологии животных НААН. Были отобраны половозрелые крысы (n = 50 гол.), живой массой (250 — 300 г.). Для контрольной группы было отобрано 10 животных, которым внутримышечно вводили физиологический раствор и отбирали образцы крови для изучения иммунологических показателей. Животным опытной группы (40 голов) вводили препарат дважды с интервалом 14 суток. Отбор и исследование проб крови проводили после введения препарата на 7, 14 и 30-е сутки эксперимента. Все манипуляции с животными проводили согласно Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и других научных целей и Закона Украины «О защите животных от жестокого обращения».
Для изучения иммунологических показателей крови использовали кровь отобранную в пробирки с К2 ЕДТА. Определяли следующие показатели: общее количество Т-лимфоцитов (Е-РОЛ) методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Jondal M. еt al., 1972), их субпопуляции Т-хелперы (Тh-Т-РОЛ; Суровас В. М. с соавт., 1980); число «активных» РOЛ (Wansbrough-Jones М. et al., 1979).
Иммунорегуляторный индекс (ИРИ) вычисляли по соотношению ТФР/ТФЧ Т-лимфоцитов, количество В-лимфоцитов (ЕАС-РОЛ) – в реакции комплементарного розеткообразования с эритроцитами барана (Чернушенко Е. Ф. с соавт., 1979). Подсчет числа Т- и В-лимфоцитов и их субпопуляций проводили на фиксированных и окрашенных мазках крови. Определяли количество лимфоцитов с низкой (3-5), средней (6-10) и высокой (М) плотностью рецепторов. Фагоцитарную активность, фагоцитарное число и интенсивность фагоцитоза определяли с суточной культурой Esherihiа coli (Гостєв В. С., 1950). Статистическую обработку полученных результатов исследований проводили с использованием программы «Exсell 2011» для Windows.
Результаты исследований. Главными иммунокомпетентными клетками, носителями иммунологической памяти и предшественниками антителообразующих клеток являются лимфоциты. Их роль в значительной степени характеризует количество Т- и В-лимфоцитов и их субпопуляций в периферической крови. Результаты проведенных исследований показали (табл.1), что относительное количество ТО-РОЛ в крови исследуемых крыс на 5 и 14-е сутки после вакцинации имела тенденцию к росту, что было достоверным, по сравнению с периодом перед вакцинацией, на 5,4% (p≤ 0,05) на 30-е сутки после вакцинации.
Таблица 1.
Количество ТО-РОЛ и их функциональная активность в крови крыс после применения препарата «Лейкозав», % (М±m; n=5-6)
| Показатели | Период исследований | |||
| перед вакцинацией (контроль) | 7 сутки после вакцинации | 14-е сутки после вакцинации | 30-е сутки после вакцинации | |
| ТО-РОЛ, 0 | 41,2±1,74 | 37,66±0,49 | 34,33±0,55** | 33,8±0,37** |
| 3-5 | 37,0±0,54 | 38,0±0,63 | 39,33±0,33* | 39,4±0,40* |
| 6-10 | 21,2±0,73 | 21,33±0,66 | 23,0±0,57 | 23,8±0,37 |
| М | 2,6±0,50 | 3,0±0,51 | 3,33±0,33 | 3,0±0,31 |
| % | 60,8±1,11 | 62,33±0,49 | 65,6±0,55 | 66,2±0,37* |
Примечание. В этой и следующих таблицах * – p<0,05; ** – p<0,01; *** – p<0,001– достоверность у животных опытной группы в сравнении с контрольной.
По степени дифференциации данной популяции клеток, наблюдалась высокая активность клеток с низкой, средней и высокой плотностью рецепторов во все периоды исследований после вакцинации. При этом количество ТО-РОЛ с низкой степенью авидности в крови крыс на 14-и 30-е сутки после вакцинации была больше (p<0,05), чем перед вакцинацией. В то же время, количество «нулевых», недифференцированных в функциональном отношении Т-лимфоцитов в крови животных после иммунизации уменьшалось и на 14- и 30-е сутки после вакцинации по сравнению с периодом перед вакцинацией и была достоверной. Подобные изменения выявлены нами также при исследовании количества Т-«активных» и теофиллин-резистентных Т-лимфоцитов в крови опытных крыс после вакцинации (табл. 2). Как видно из полученных результатов исследований количество ТО-РОЛ в крови крыс на 14-и 30-е сутки после вакцинации было больше (p<0,01; p<0,001), чем перед вакцинацией. Эти изменения происходили за счет увеличения количества Т- «активных» лимфоцитов с низкой (p<0,05; p<0,01) и на 30-е сутки с средней (p<0,01) плотностью рецепторов и снижения количества «нулевых», недифференцированных в функциональном отношении клеток (p<0,01-0,001).
Таблица 2
Количество ТО-РОЛ и их функциональная активность в крови крыс при применении препарата «Лейкозав», % (М±m; n=5-6)
| Показатели | Период исследований | |||
| перед вакцинацией (контроль) | 7 сутки после вакцинации | 14-е сутки после вакцинации | 30-е сутки после вакцинации | |
| ТА-РОЛ, 0 | 64,0±0,63 | 64,33±0,71 | 59,0±1,15** | 55,8±0,73*** |
| 3-5 | 29,8±0,86 | 29,5±0,56 | 32,83±0,70* | 35,4±0,67** |
| 6-10 | 5,6±0,43 | 5,5±0,42 | 6,66±0,42 | 7,8±0,37** |
| М | 1,0±0 | 1,0±0 | 1,4±0,24 | 1,25±0,25 |
| % | 36,0±0,63 | 35,66±0,71 | 41,0±1,15** | 44,2±0,73*** |
Известно, что популяция Т-лимфоцитов крови состоит из нескольких субпопуляций, клетки которых отличаются функциональным состоянием. Поэтому использование в исследованиях теста «активного» розеткообразования позволяет определить субпопуляцию Т-клеток, которые имеют высокоаффинные рецепторы к индикаторным клеткам (эритроцитов) и активно взаимодействуют с ними без дополнительной сенсибилизации.
Важное значение при исследовании иммунного ответа организма в условиях вакцинации имеют Т-хелперы (Тh) и Т-супрессоры (Тs), которые представляют собой основную популяцию иммунорегуляторных клеток. По данным таблицы 3 видно, что на 14-и 30-е сутки после вакцинации, по сравнению с периодом перед вакцинацией, в крови крыс зафиксировано большее количество теофиллин-резистентных Т-лимфоцитов (p<0,05). При этом, количество Тh-лимфоцитов с низкой и средней плотностью рецепторов была больше (p<0,05), а недифференцированных (нулевых) – меньше (p<0,05), чем их количество в крови животных перед вакцинацией.
Таблица 3
Количество Тh- и Тs-лимфоцитов в крови крыс при применении препарата «Лейкозав», % (М±m; n=5-6)
| Показатели | Период исследований | |||
| перед вакцинацией (контроль) | 7 сутки после вакцинации | 14-е сутки после вакцинации | 30-е сутки после вакцинации | |
| Тh, 0 | 65,0±0,83 | 67,33±0,55 | 61,5±1,08* | 58,0±0,70* |
| 3-5 | 22,4±0,67 | 23,0±0,36 | 24,5±0,42* | 26,0±0,31* |
| 6-10 | 10,8±0,58 | 8,5±0,76* | 11,66±0,71 | 13,4±0,50* |
| М | 2,25±0,47 | 2,8±0,58 | 2,33±0,33 | 2,6±0,50 |
| % | 35,0±0,83 | 33,83±0,30 | 38,5±1,08* | 42,4±0,70* |
| Тs, % | 25,8±1,28 | 28,5±0,56 | 27,2±0,20 | 23,8±0,73* |
| ИРИ | 1,35±0,15 | 1,18±0,19 | 1,41±0,33 | 1,78±0,09* |
Результаты исследований теофиллин-чувствительных Т-лимфоцитов в крови крыс показали, что их количество на седьмой день после вакцинации имело тенденцию к росту, а на 14- и 30-е сутки после вакцинации снижалось по сравнению с периодом до вакцинации. При этом на 30-е сутки после вакцинации разницы в количестве Тs были достоверны.
Иммунорегуляторный индекс (ИРИ), который характеризует отношение Т-хелперов к Т-супрессорам, на 7-е сутки после вакцинации снижался, а на 14- и 30-е сутки после вакцинации был соответственно на 4,4 и 31,8% (p<0,05) больше, чем до вакцинации (табл. 3).
Трансформация лимфоцитов в бласты – это процесс иммунной активации малых лимфоцитов, которые в состоянии покоя являются относительно неактивными клетками. При исследовании функциональной активности Т-лимфоцитов в реакции бластной трансформации (РБТЛ) с фитогемаглютинином (ФГА) установлено, что количество бластных клеток в крови крыс после вакцинации растет (табл. 4). При этом, по 14- и 30-е сутки после вакцинации их количество было соответственно на 8,2 (p<0,05) и 8,4% (р<0,01) больше, чем перед вакцинацией. Эти данные свидетельствуют о стимулирующем влиянии исследуемого препарата на бластогенез Т-лимфоцитов в крови крыс.
Таблица 4
Функциональная активность Т-лимфоцитов в РБТЛ с ФГА при действии препарата «Лейкозав», % (М±m; n=5-6)
| Показатели | Период исследований | |||
| перед
вакцинацией (контроль) |
7 сутки после вакцинации | 14-е сутки после вакцинации | 30-е сутки после вакцинации | |
| РБТЛ c ФГА | 30,8±1,24 | 34,0±1,58 | 39,0±2,16* | 39,2±1,46** |
Исследование активности В-лимфоцитов характеризует уровень гуморального звена иммунитета. Как видно из полученных результатов исследований (табл.5), введение исследуемого препарата лабораторным животным вызвало подобный характер изменений количества В-лимфоцитов в крови, и при исследовании Т-клеточного звена иммунитета. Так, на 14-и 30-е сутки после вакцинации в крови крыс достоверно возрастает количество ЕАС-РОЛ по сравнению с контролем. Увеличение количества В-лимфоцитов в крови крыс происходит за счет перераспределения рецепторного аппарата иммунокомпетентных клеток в сторону роста их авидности. В частности, увеличивается количество ЕАС-РОЛ с низкой (p<0,05) и средней плотностью рецепторов и уменьшается (p<0,01) недифференцированная популяция В-лимфоцитов.
Таблица 5
Относительное количество В-лимфоцитов и их функциональная активность в крови крыс при применении препарата «Лейкозав», % (М±m; n=5-6)
| Показатели | Период исследований | |||
| перед вакцинацией
(контроль) |
7 сутки после вакцинации | 14-е сутки после вакцинации | 30-е сутки после вакцинации | |
| ЕАС-РОЛ, 0 | 77,6±0,67 | 76,5±0,76 | 74,0±0,63** | 73,4±0,74** |
| 3-5 | 15,2±0,80 | 15,33±0,66 | 16,6±0,66 | 17,6±0,50* |
| 6-10 | 7,0±0,83 | 7,83±0,30 | 8,16±0,40 | 8,2±0,37 |
| М | 1,0±0 | 1,0±0 | 1,4±0,24 | 1,33±0,33 |
| % | 22,4±0,67 | 23,5±0,76 | 26,0±0,63* | 26,6±0,74** |
Следовательно, введение лабораторным животным препарата «Лейкозав» приводит к увеличению в их крови количества Т-лимфоцитов (общих, активных и теофиллин-резистентных) и В-лимфоцитов, а так же повышает функциональную активность иммунокомпетентных клеток за счет перераспределения рецепторного аппарата Т- и В-лимфоцитов в сторону увеличения их авидности. При этом зафиксировано снижение количества теофиллин-чувствительных Тs через 30 суток после вакцинации и повышения ФГА-индуцированной пролиферативной активности Т-лимфоцитов в крови исследуемых животных.
Фагоциты являются основными активными компонентами клеточной защиты. Из данных, приведенных в табл. 6 видно, что фагоцитарная активность нейтрофилов крови у крыс на 7- и 14-е сутки после вакцинации проявляла тенденцию к снижению, а на 30-е сутки повышалась, однако разницы по сравнению с периодом перед вакцинацией были не достоверны.
Интенсивность фагоцитоза характеризует фагоцитарный индекс (ФИ) и фагоцитарное число (ФЧ). Фагоцитарный индекс, характеризующий количество захваченных микроорганизмов одним активным фагоцитом в крови крыс. На 14-и 30-е сутки после вакцинации был соответственно на 14,6 и 49,1% (p <0,01) больше, чем до вакцинации. Фагоцитарное число (ФЧ), выражающее количество фагоцитированных микробных клеток на 100 подсчитанных лейкоцитов в крови крыс на 14- и 30-е сутки после вакцинации растет соответственно на 29,9 и 59,3% (p <0,05).
Таблица 6
Показатели фагоцитоза нейтрофилов крови крыс при действии препарата «Лейкозав», (М±m; n=5-6)
| Показатели | Период исследований | |||
| перед вакцинацией (контроль) | 7 сутки после вакцинации | 14-е сутки после вакцинации | 30-е сутки после вакцинации | |
| ФА, % | 34,0±3,03 | 33,6±1,72 | 30,8±2,14 | 36,4±2,85 |
| ФЧ, од. | 1,94±0,34 | 1,89±0,19 | 2,52±0,20 | 3,09±0,26* |
| ФИ, од. | 5,68±0,79 | 5,58±0,32 | 6,51±1,43 | 8,47±0,19** |
Введение животным исследуемого препарата не существенно повлияло на фагоцитарную активность нейтрофилов крови, но оказало стимулирующее воздействие на интенсивность фагоцитоза.
Выводы и перспективы. 1. Введение лабораторным животным препарата «Лейкозав» приводит к увеличению (p<0,05-0,001) в их крови количества Т-лимфоцитов (общих, активных и теофиллин-резистентных) и В-лимфоцитов, повышает функциональную активность иммунокомпетентных клеток за счет перераспределения рецепторного аппарата Т- и B-лимфоцитов в сторону увеличения (р<0,05-0,01) их авидности. При этом зафиксировано снижение (p ≤ 0,05) количества теофиллин-чувствительных Тs через 30 суток после вакцинации и повышения (p<0,05-0,01) ФГА-индуцированной пролиферативной активности Т-лимфоцитов в крови исследуемых животных. 2. Введение животным исследуемого препарата приводило к росту фагоцитарного числа (p<0,05) и фагоцитарного индекса (p<0,01) через 30 суток после иммунизации, что свидетельствует о стимулирующем влиянии препарата на интенсивность фагоцитоза. 3. В перспективе, необходимо продолжить исследования влияния препарата «Лейкозав» на другие составляющие иммунной системы лабораторных животных, что актуально при подготовке препарата для сертификации.