МИКРОБНОЕ СООБЩЕСТВО ФИЛЛОСФЕРЫ И РИЗОСФЕРЫ РАСТЕНИЙ ГОРОХА ОВОЩНОГО

Ладутько Е.И.

Институт миркобиологии Национальной академии наук Беларуси,

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

Леонович С.И.

Институт миркобиологии Национальной академии наук Беларуси,

младший научный сотрудник

Калинина А.Н

ФГБУ «государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов национального исследовательского центра «Курчатовский институт»,

научный сотрудник

Соколина Л.Н.

РУП «Минская ОСХОС НАН Беларуси»

Заведующая отделом семеноводства зерновых и зернобобовых культур

Заборонок И.М.

РУП «Минская ОСХОС НАН Беларуси»,

директор

Новик Г.И.

Институт миркобиологии Национальной академии наук Беларуси,

кандидат биологических наук,

заведующий лабораторией

Ladutska A.I.

Institute of Microbiology Belarus National Academy of Sciences,

Candidate of Biol. Sci., leading researcher

Leanovich S.I.

Institute of Microbiology Belarus National Academy of Sciences,

Junior researcher

Kalinina A.N.

Federal Institution «State Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms of the National Research Center» Kurchatov Institute»,

researcher

Sokolina L.N.

Repablican unitary enterprise Regional Agricultural Experiment

Station of the Belarus National Academy of Science,

Head of the Department of seed grain and leguminous crops,

Zaboronok I.M.

Repablican unitary enterprise Regional Agricultural Experiment

Station of the Belarus National Academy of Sciences,

Director

Novik G.I.

Institute of Microbiology Belarus National Academy of Sciences,

Candidate of Biol. Sci., head of laboratory

MICROBIAL COMMUNITY OF PHYLOSPHERE AND RIZOSPHERE OF PLANTS OF GREEN PEA

МИКРОБНОЕ СООБЩЕСТВО ФИЛЛОСФЕРЫ И РИЗОСФЕРЫ РАСТЕНИЙ ГОРОХА ОВОЩНОГО

Summary: The quantitative and qualitative composition of microorganisms isolated from the rhizosphere and phyllosphere of leguminous plants (Fabacaea): green pea Pisum sativum L. was studied. Molecular-genetic identification of the isolates of bacterial cultures was performed. The isolated microorganisms are represented by Gram-negative bacteria of Pseudomonas genus, spore-forming bacteria of the genus Bacillus, enterobacteria of genera Erwinia, Serratia, proteobacteria of genera Burkholderia, Proteobacter, Polaromonas, actinobacteria of genera Arthrobacter, Kitasatospora, flavobacteria of genus Flavobacterium. The molecular typing of isolated bacterial cultures was carried out. Electrophoretic profiles were characterized by specific individual amplicons, differed in the number and size of PCR products, allowing differentiating them and revealing the intraspecific genetic heterogeneity of most bacterial strains from the phyllosphere and rhizosphere of the green pea.

Аннотация. Изучен количественный и качественный состав микроорганизмов, выделенных из ризосферы и филлосферы растений семейства Бобовые (Fabacaea): гороха овощного Pisum sativum L. Выполнена молекулярно-генетическая идентификация изолятов бактериальных культур. Выделенные микроорганизмы представлены грамотрицательными бактериями рода Pseudomonas, спорообразующими бактериями рода Bacillus, энтеробактериями родов Erwinia, Serratia, протеобактериями родов Burkholderia, Proteobacter, Polaromonas, актинобактериями родов Arthrobacter, Kitasatospora, флавобактериями рода Flavobacterium. Выполнено молекулярное типирование выделенных бактериальных культур. Электрофоретические профили характеризовались специфическими индивидуальными ампликонами, отличались по количеству и размеру ПЦР-продуктов, что позволило их дифференцировать и выявить внутривидовую генетическую гетерогенность большинства бактериальных штаммов филлосферы и ризосферы гороха овощного.

Key words: rhizosphere, phyllosphere, green pea Pisum sativum L, Pseudomonas, Bacillus, molecular-genetic identification, molecular typing.

Ключевые слова: ризосфера, филлосфера, горох овощной Pisum sativum L, Pseudomonas, Bacillus, молекулярно-генетическая идентификация, молекулярное типирование.

Введение. В процессе своей жизнедеятельности растения входят в сложные взаимоотношения с микроорганизмами, населяющими не только почву, но и эндоткани здоровых растений. Исследование закономерностей этой эволюционно сложившейся биологической системы позволяет разрабатывать и обосновывать безопасные для окружающей среды биологические методы защиты растений. В связи с переходом к биологическому земледелию и интенсивно разрабатываемым методам биологической защиты растений с использованием бактерий рода Bacillus и Pseudomonas в качестве агентов биологического контроля растений [1, 2], изучение количественного и качественного состава ризосферной и филлосферной микрофлоры является одной из актуальных проблем современной микробиологии. Значительный удельный вес этих бактерий в почве и в составе эпифитной микрофлоры растений, эволюционно сложившиеся симбиотические отношения с растением и высокая антагонистическая активность к патогенным микроорганизмам обосновывает высокий интерес микробиологов к данной группе бактерий. Поверхность растений заселена огромным числом микроорганизмов. Количество микроорганизмов, обнаруживаемых на поверхности листьев растений составляет порядка 108 клеток на грамм свежих листьев, или 106 на 1 см2, что вполне сопоставимо с численностью микроорганизмов в почве [6]. Поскольку каждый из органов растений представляет особую эконишу, по отношению к населяющим их микроорганизмам, используют термины, определяющие эти ниши: филлосфера – надземные части растений, филлоплана – листья растений, ризоплана и ризосфера – корни растений и прилегающая к ним почва [7]. Известно, что способность адаптироваться к неблагоприятным условиям среды путем объединения с симбиотическими микроорганизмами – неотъемлемое свойство растительной формы жизни, без учета которого невозможно изучение экологии растений. Изучение эпифитной микрофлоры в большинстве случаев связано также с проблемами фитопатологии.

Цель исследования. Изучить количественный и качественный состав микроорганизмов, выделенных из ризосферы и филлосферы растений семейства Бобовые (Fabacaea): гороха овощного Pisum sativum L.

Объектом исследования являлись микроорганизмы, изолированные из ризосферы и филлосферы растений семейства Бобовые (Fabacaea): гороха овощного Pisum sativum L., произрастающего на полях РУП «Минская сельскохозяйственная опытная станция НАН Беларуси».

Материалы и методы. При отборе материала с корневого кома стряхивали почву, корни отделяли от надземной части растений Pisum sativum, учитывая, что на поверхности корней и в прикорневой зоне (слой почвы толщиной 5-10 мм) отмечается высокая концентрация микроорганизмов. Надземные части растений измельчали. Исследуемый материал по отдельности тщательно смешивали со стерильным раствором дистиллированной воды, делали ряд десятикратных разведений. Бактериальную суспензию (100 мкл) из разведений 10^-3 – 10^-7 высевали на плотные питательные среды: МПА, ГРМ-агар, картофельно-глюкозный агар и инкубировали при температуре 28^оC в течение 48 ч. Для идентификации клубеньковых бактерий использовали маннитно-дрожжевую среду. Для учёта численности грибов применяли агаризованную среду Чапека. Численность актиномицетов определяли на агаровой крахмалоаммиачной среде [5]. Пробы для изучения динамической численности физиологических групп бактерий из ризосферы и травянистой части растений гороха отбирали трижды в течение вегетационного периода. Морфологию колоний и клеток бактерий изучали методом световой микроскопии при увеличении 1×40 и 1×1000 соответственно, используя микроскоп Nicon Eclipse Е2000 (Япония). При микроскопии клеток использовали окрашивание по методу Грама [6]. Идентификацию микроорганизмов проводили на основе изучения морфологических, культуральных, физиолого-биохимических свойств выделенных микроорганизмов в соответствии с Определителем бактерий Берджи (1997), а также при помощи молекулярно-генетического метода идентификации на основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК.

Хромосомную ДНК бактерий выделяли при помощи наборов реагентов «Jena» (Германия). Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали праймеры и реагенты производства «Праймтех» (Беларусь). Амплификацию нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК проводили с универсальными эубактериальными праймерами 8f (5ʹ-agagtttgatcctggctcag-3ʹ) и 1492r (5ʹ-ggttaccttgttacgactt-3ʹ), используя температурно-временной профиль: 95°С – 3 мин (1 цикл); 95°С – 30 с, 57°С – 30 с, 72°С – 1,5 мин (35 циклов); 72°С – 5 мин (1 цикл). В качестве стандартов для определения размера продуктов ПЦР применяли маркер молекулярной массы фрагментов Gene Ruler DNA Ladder 1Kb Plus («Fermentas», Литва).

Для очистки амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК использовали набор DNA Extraction kit («Thermo Scientific», Литва). Реакцию секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК проводили на автоматическом секвенаторе АЕ3000 с использованием набора реагентов для секвенирования BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems», США). Для анализа результатов секвенирования и редактирования последовательностей применяли программу eSeq. Сравнительный анализ секвенированных фрагментов генов выполняли с использованием программы BLAST базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.).

Для проведения молекулярного типирования геномной ДНК использовали праймеры М13 (5’-gagggtggcggttct-3’) и 1254 (5’-ccgcagccaa-3’). Амплификацию проводили в оптимизированных условиях на автоматическом термоциклере Mastercycler^®pro (Eppendorf) и SureCycler 8800 Thermal Cycler (Agilent Technologies). В работе использовали реагенты и праймеры производства «Праймтех» (Беларусь). На один образец готовили реакционную смесь, содержащую буфер АМ (х10) для Taq-полимеразы (2 мкл), 0,25 мкл. Taq-полимеразы, 1 мкл каждого праймера (при концентрации 10 pmol/µl), 1 мкл ДНК-матрицы и бидистиллированную воду (15,75 мкл). Общий объем реакционной смеси составлял 20 мкл. Реакцию амплификации c праймером М13 проводили, используя следующий температурно-временной профиль: денатурация 3 мин при 95ºС, 39 циклов элонгации – 95ºС – 30 с, 45ºС – 30 с, 72ºС – 2 мин, достройка цепи 5 мин при 72ºС; охлаждение до 4ºС. Для реакции амплификации c праймером 1254: денатурация 3 мин при 95ºС, 39 циклов элонгации – 95ºС – 30 с, 45ºС – 30 с, 72ºС – 1 мин, достройка цепи 5 мин при 72ºС; охлаждение до 4ºС.

Образцы ДНК и продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле с использованием 1×ТАЕ-буфера при напряженности электрического поля 5 В/см в течении 45 мин [7]. Для визуализации ДНК гель окрашивали раствором бромистого этидия в концентрации 0,05 мкг/мл. В качестве стандарта для определения размера продуктов ПЦР применяли маркер молекулярной массы ДНК O’GeneRuler Mix DNA Ladder (ThermoScientific). Образцы по 3 мкл смешивали с 1 мкл красителя 6х Orange 2D (ThermoScientific) и далее 3 мкл смеси загружали в лунки агарозного геля.

Эксперименты проводили в трехкратной повторности. Статистический анализ результатов осуществляли, используя пакет программ Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение.

В данной работе изучен количественный и качественный состав микрофлоры филлосферы и ризосферы гороха овощного Pisum sativum L.

Из наземных частей растений гороха, корней и прилегающей к ним почвы выделены изоляты 50 бактериальных культур. Изучены морфологические, культуральные и физиолого-биохимические свойства выделенных микроорганизмов, выполнена молекулярно-генетическая идентификация типичных представителей бактериальной флоры филлосферы и ризосферы гороха.

В результате исследования было установлено, что количество бактерий, населяющих ризосферу, Pisum sativum L., составляет ~ 95%. Причем бактерий рода Bacillus составляют ~ 41%, грамотрицательные бактерии рода Pseudomonas ~ 25%, микобактерии ~ 14,4%, ризобии ~ 9,3% от общего числа бактерий. Другая бактериальная флора, представленная бактериями родов: Proteobacter sp., Azotobacter sp., Arthrobacter sp., Streptomyces sp. составляет ~ 5,5%. Доля актиномицетов ~ 1,5%, микроскопических грибов ~ 0,4% (таблица 1). Следует отметить, что выделенные виды бацилл, ризосферный эффект которых равен 1 [8, 9], составляют большую часть от общего количества бактерий и обеспечивают исследуемые растения нитратами за счет фиксации атмофсерного азота [10].

Таблица 1. Количественный состав ризосферной микрофлоры гороха овощного Pisum sativum L.

Взаимоотношения растений с корневой микрофлорой носят чаще всего характер раздельного симбиотрофизма, то есть эти отношения обоюдно полезны и растениям, и микроорганизмам. Микроорганизмы питаются выделениями растений и, размножаясь на корнях, оказывают разностороннее влияние на питание растений, в том числе и на поступление веществ в корни. Бактерии родов Bacillus и Pseudomonas, выявленные в ризосфере гороха, известны как агенты биоконтроля многих фитопатогенных грибов рода Fusarium. Защитный эффект флуоресцирующих псевдомонад связан не только с продукцией антифунгальных метаболитов, но и со способностью, быстро колонизируя корни, успешно конкурировать с фитопатогенными грибами [11]. Основой биологической защиты служит явление антагонизма между эндофитными и фитопатогенными микроорганизмами.

Микрофлора филлосферы отдельных видов растений характеризуется большой вариабельностью, как по численности, так и по составу в зависимости от сезонного развития растений, вегетационного периода, их бактерицидной активности и метеорологических условий. На листьях и стеблях формируется микробный комплекс, изменяющийся по мере развития растений и отличающийся определенным соотношением отдельных групп и видов микроорганизмов. В начале вегетации филлоплана растений заселена, главным образом, бактериальным сообществом. На стареющих листьях и стеблях повышается содержание дрожжей и микроскопических грибов [12].

При анализе микрофлоры филлосферы гороха овощного выявлены грамотрицательные бактерии рода Pseudomonas ~ 38%, коринеформные бактерии ~ 23,8%, энтеробактерии ~ 22,5% и флавобактерии ~ 8,7%, а также микроскопические грибы ~ 0,6%. Данные представлены в таблице 2.

Таблица 2. Количественный состав микрофлоры филлосферы гороха овощного Pisum sativum L.

Эпифитные микроорганизмы являются эккрисотрофами, то есть используют в качестве источника питания растительные экссудаты. Количество эпифитных бактерий зависит от вида растения. На количество бактерий также влияет степень зрелости растения — с возрастом растения микробное сообщество на нем увеличивается. До сих пор остается открытой тема видоспецифичности эпифитной микрофлоры.

При изучении микрофлоры наземных частей гороха овощного установлено наличие важной для биоценозов функциональной группы микроорганизмов – азотфиксаторов или диазатрофов. Это бактерии, относящиеся к родам Arthrobacter и Flavobacterium. Энтеробактерии родов Erwinia и Serratia, обнаруженные в филлосфере гороха овощного, сапрофиты, являются составной частью эпифитной микрофлоры растений [13].

Значение эпифитной микрофлоры в жизни растений весьма разнообразно. Среди эпифитной микрофлоры есть микроорганизмы образующие биотические вещества — витамины, ауксины, фолиевую кислоту, тиамин, рибофлавин и другие соединения, а также антибиотические вещества с резко выраженными антимикробными свойствами. Обладая значительным набором ферментов, бактерии рода Arthrobacter активно участвуют в круговороте веществ в природе, осуществляя процессы аммонификации и нитрификации, фиксации атмосферного азота и превращения труднодоступных для других микроорганизмов веществ; активно продуцируют аминокислоты, витамины, ауксины, внеклеточные полисахариды и пигменты. Бактерии данного рода широко используются в микробиологической промышленности как продуценты органических кислот, производных и предшественников нуклеиновых кислот, свободных аминокислот, протеолитических ферментов [13].

Бактерии рода Rhizobium колонизируют клетки корня растения, образуя корневые клубеньки. В условиях с пониженным содержанием кислорода бактерии преобразуют атмосферный азот в аммиак, обеспечивая растению доступ к органическому азоту в форме глутамина или уреидов. В обмен растение поставляет бактериям сахара, образовавшиеся в ходе фотосинтеза [14, 15].

Микроскопические грибы, обнаруженные на листьях и стеблях гороха, это отдельная экологическая группа микроорганизмов, обитающих на наземной части растений, отличающаяся значительным видовым разнообразием. В качестве источника питания, вегетируя на листьях, данные микрорганизмы используют различные соединения – углеводы, аминокислоты и др. На поверхность листьев и стеблей грибы попадают с частицами пыли и пыльцой других растений. Для некоторых микроскопических грибов филлосфера стала основным местообитанием в природе. Многие виды обнаруживаются в природе лишь на поверхности листьев. Для обитателей филлосферы характерна повышенная устойчивость к действию фитонцидов растений и ксерофильность, они хорошо адаптированы к распространению в природе с помощью воздушных течений. Находясь на поверхности листьев, грибы подвергаются непосредственному воздействию атмосферных факторов: изменению температуры, влажности и др. Поскольку эти параметры чрезвычайно вариабельны, грибы филлосферы имеют широкий диапазон устойчивости. Наиболее типичными представителями данной экологической группы грибов являются виды родов тиллетиевидных грибов и спороболомицитов [16].

Ранее нами установлена антагонистическая активность выделенных культур бактерий Sv13, Sv17 и Г6 по отношению к фитопатогенным грибам родов Alternaria, Fusarium, Rhizoctonia [17]. Также среди выделенных бактерий рода Bacillus присутствуют культуры чувствительные к бактериофагам.

Анализ количественного и качественного состава микроорганизмов филлосферы и ризосферы выявил начальный процесс формирования микробно-растительных взаимодействий, характеризующийся невысокой общей численностью микроорганизмов, преобладанием физиологических групп микроорганизмов, использующих минимальное содержание питательных веществ в субстрате и минеральные формы азота. В процессе жизнедеятельности в прикорневой зоне растений Pisum sativum L уменьшается численность аэробных гетеротрофных бактерий, азотфиксирующих бактерий и актиномицетов. Численность нитрифицирующих бактерий и микромицетов возрастает.

Для определения видового разнообразия бактериальной микрофлоры филлосферы и ризосферы гороха овощного выполнена молекулярно-генетическая идентификация изолятов бактериальных культур. Выделенные микроорганизмы представлены грамотрицательными бактериями рода Pseudomonas, спорообразующими бактериями рода Bacillus, энтеробактериями родов Erwinia, Serratia, протеобактериями родов Burkholderia, Proteobacter, Polaromonas, актинобактериями родов Arthrobacter, Kitasatospora, флавобактериями рода Flavobacterium.

На основании данных нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК установлена таксономическая принадлежность выделенных бактериальных культур. Видовой состав представителей микрофлоры гороха представлен следующими идентифицированными микроорганизмами: B. aryabhattai, B. weihenstephanensis, B. simplex, Pseudomonas sp., P. costantinii., P. rhizosphaerae, Arthrobacter sp., Burkholderia graminis, Streptomyces sp., Kitasatospora kifunensis, Polaromonas jejuensis, Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Erwinia aphidicola, Serratia plymuthica, Erwinia rhapontici, Flavobacterium banpakuense. Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты молекулярно-генетической идентификации бактериальных культур филлосферы и ризосферы гороха овощного

Согласно данным литературы [18, 19, 20], геномы бактерий характеризуются наличием нескольких категорий повторяющихся последовательностей, таких как гены рРНК, тРНК, IS элементы, а также прямые повторяющиеся последовательности длиной 20–50 п.н. К последней категории относятся rep-последовательности – повторы длиной 32 п.н., локализованные вне кодирующей области бактериального генома. Было показано, что праймеры, комплементарные консенсусной последовательности ДНК-мишени, могут быть успешно использованы для анализа различных бактериальных геномов. Метод RAPD-ПЦР с использованием праймеров 1254 и М13 зарекомендовал себя как нетрудоемкий и доступный подход к типированию микроорганизмов и выявлению их идентичности.

Выполнено молекулярное типирование выделенных бактериальных культур. При проведении RAPD-PCR с праймером M13 число ПЦР-фрагментов в фингерпринтах варьирует от 4 до 12, размером ~ 250-10000 п.н. При амплификации с праймером 1254 получены штаммоспецифичные профили, содержащие от 3 до 10 ампликонов размером ~ 210-3650 п.н.

А

Б

Рис. 1. – Продукты амплификации ДНК бактериальных изолятов, выделенных из почвы. А — праймер 1254, Б — праймер М13

Для нескольких изолятов Sv2 и Sv5, фингерпринты, полученные с праймерами M13 и 1254, были одинаковыми, что указывает на идентичность выделенных штаммов. Электрофореграммы ПЦР-продуктов представлены на рисунке 1.

Электрофоретические профили характеризовались специфическими индивидуальными ампликонами, отличались по количеству и размеру ПЦР-продуктов, что позволило их дифференцировать и выявить внутривидовую генетическую гетерогенность большинства бактериальных штаммов филлосферы и ризосферы гороха овощного.

Заключение. Изучив количественный и качественный состав микрофлоры филлосферы и ризосферы гороха овощного, можно сделать вывод об оправданном и целесообразном использовании данного вида растений в севообороте сельскохозяйственных культур. Присутствие достаточного количества и видового разнообразия микроорганизмов в филлосфере и ризосфере гороха овощного способствует насыщению возделываемых почв легкоусвояемыми для культурных растений фосфатами и азотом, благодаря чему увеличивается коэффициент использования фосфорных удобрений и почвенных фосфатов [21, 22]. Среди эпифитной микрофлоры имеется немало антагонистов, образующих антибиотические вещества, которые подавляют развитие фитопатогенных микроорганизмов. Развиваясь обильно на растениях, такие микроорганизмы могут выполнять защитные функции, устраняя или подавляя возбудителей инфекций, попадающих извне [23]. Направленное влияние на состав эпифитной микрофлоры на поверхности зеленых частей растений, создание на их поверхности эффективных биоценозов антагонистов, в перспективе, может оказаться весьма ценным для промышленного растениеводства.

Литература:

1. Носонова Т.Л., Мандрик-Лтьвинкович М.Н., Молчан О.В. Бактерии Bacillus amyloliquefaciens 355 с комплексной антимикробной, ростстимулируещей и целлюлолитической активностями. Сб. науч. трудов Инститата микробиологии НАН Беларуси «Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты» Т. 8. 2016. С. 226-234.

2. Болотник Е.В., Молчан О.В., Романовская Т.В., Шабанов А.А., КоломиецЭ.И. применение биодинамических препаратов в органическом растениеводстве (обзор). Сб. науч. трудов Инститата микробиологии НАН Беларуси «Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты» Т. 9. 2017 С. 165-182.

3. Шили Б. Местообитание прокариот/ Б.Шили; перевод К.Л. Тарасова// Современная микробиология. Прокариоты. 2005. С. 254-306.

4. Торопова Г.В. Особенности жизнедеятельности комнатных растений в сезонной динамике по индикаторным симбиотрофным бактериям: Дис. канд. биол. наук / Москва. 2005. – 124 с.

5. Желдакова, З.А. Мямин В.Е. Фитопатогенные микроорганизмы / Минск: БГУ, 2006. С. 23-69.

6. Нетрусов, А.И. .А. Егорова, Л.М. Захарчук. Практикум по микробиологии / Москва: Академия. 2005. – 608 с.

7. Westermeier R., Electrophoresis in Practice / Weinheim: Wiley-VHC, 2005. – 407 p.

8. Miller M.B., Bassler B.L. Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol. 2001. Vol. 55. P. 165-199.

9. Мишустин Е.Н. Емцов В.Т. Микробиология / М.: Агропромиздат, 1992.- 445 с.

10. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация / Москва: МГУ. 1996. – 136 с.

11. Захарченко Н.С., Чепурнова М.А., Карнова Л.С., Захарченко А.В., Пиголева С.В., Пунтус И.Ф., Кочетков В.В. Влияние ассоциативных микроорганизмов на устойчивость томатов к фитопатогенам in vitro и in vivo. Известия Тульского государственного университета, Естественные науки. 2010. Вып. 1. С. 175–185

12. Боронин, А.М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений. Соросовский обр. журн. 1998. № 10. С. 25–31.

13. Лысак, В.В. Микробиология : учеб. пособие / Минск : БГУ, 2007. – 426 с.

14. Blagova D.K., Vershinina Z.R., Nigmatullina L.R., Lavina A.M., Baimiev An.Kh., Baimiev Al.Kh. Artificial associative symbioses between tomato plants and fungistatic rhizobium. Agricultural biology. 2015. V. 50. P. 107-114.

15. Arfa ui B., Sifi A., Boudabous I., Hadrami El., Cherif M. Identification of Rhizobium isolates possessing antagonistic activity against Fusarium oxysporum f. sp. ciceris, the causal agent of Fusarium wilt of chickpea. J. Plant Pathol. 2006. Vol. 88. P. 67-75.

16. Онищенко В. Справочник грибника. / Литагент «Фолио». 2005. – 69 c.

17. Леонович С.И., Калинина А.Н., Кантерова А.В., Ладутько Е.И., Новик Г.И. Изоляция и характеристика бактерий, обладающих антифунгальной активностью в отношении фитопатогенных грибов родов Rhizoctonia, Fusarium, Alternaria. Сб. науч. трудов Инститата микробиологии НАН Беларуси «Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты» Т. 10. 2018. С. 98-106.

18. EpplenH J., Ammer T., Epplen C., Oligonucleotide fingerprinting using simple repeat motifs: a convenient, ubiquitously applicable method to detect hypervariability for multiple purposes. EXS. 1991. Vol. 58. P. 50–69.

19. Евдокимова О.В. Мямин В.Е., Валентович Л.Н. Биохимическая и молекулярно-генетическая характеристика бактерий Bacillus pumilus, изолированных  на  территории Беларуси. Журнал Белорусского государственного университета. Биология. 2018. № 1. С. 38 – 49.

20. Кузнецова М.В., Максимова А.В., Карпунина Т.И. Опыт использования rep- и rapd-полимеразной цепной реакции для эпидемиологической характеристики нозокомиальных изолятов Pseudomonas aeruginosa. Клиническая лабораторная диагностика. № 3. 2015. С.44-50.

21. Турина Е.Л., Дидович С.В., Абдурашитов С.Ф., Кулинич Р.А., Биологизация технологий выращивания бобовых культур. Вестник Брянской государственной сельскохозяйственной академии. 2015. С 2-5.

22. Мельничук Т.Н., Еговцева А.Ю., Гонгало А.А., Абдурашитова Э. Р., Абдурашитов С.Ф., Женченко К.Г Влияние комплекса микробных препаратов на численность микроорганизмов ризосферы гороха. Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2017. С 235-237.

23. Дидович С. В., Горгулько Т. В., Кулинич Р. А., Абдурашитов С. Ф., Турина Е. Л., Дидович А. Н. Влияние полифункциональных биопрепаратов на микробиологические процессы в ризосфере и продуктивность бобовых культур. Вестник Уманского национального университета садоводства. №2. 2014. С 14-1.